陆地棉亚红株（Rs）候选基因的克隆和功能分析

【摘要】陆地棉亚红株(凰)基因是新发现的一个棉花遗传标记基因。亚红株棉的淡红叶色介于经典红株棉和正常绿株棉之间,而丌花当天的花瓣颜色较经典红株棉深。此外,相较经典的红株棉和正常的绿株棉,亚红株棉的光合效率更高。明确陆地棉亚红株突变体中花色素合成调控的关键基因,不仅为尺s基因的图位克隆奠定基础,还为棉花的高光效育种提供一定的理论依据。前人将Rs基因初步定位于棉花A基因组的第7号染色体上,与陆地棉经典红株(R1)基因在D基因组第16号染色体上的座位对应。课题组前期从陆地棉经典红株植株中克隆了与拟南芥PAP1同源的GhPAP1D基因,并预测GhPAP1D基因是R1基因的候选基因。为探究亚红株棉中的花色素调控基因,本研究从亚红株棉中克隆了PAP1的同源基因,并对这些同源基因进行了序列分析、转基因烟草的功能验证和基因连锁分析。主要结果如下：1.陆地棉PAP1同源基因的克隆与序列分析根据D基因组中GhPAP1D对应区段的序列,从陆地棉中克隆了另外3个PAP1同源基因,分别命名为：GhPAP1A、GhPAP2A和GhPAP2D。cDNA从亚红株棉和正常绿株棉两种材料中克隆获得3个PAP1同源基因的共6个cDNA序列。核苷酸序列比对发现,GhPAP1A基因的cDNA序列在两种材料中存在3个碱基的差异,而GhPAP2A和GhPAP2D基因的碱基序列在两种材料中完全一致。多重序列比对表明陆地棉PAP1同源蛋白(GhPAP1A、GhPAP2A、GhPAP1D和GhPAP2D)和可可、拟南芥、花椰菜等物种中的R2R3-MYB蛋白在R2R3MYB结构域具有高度的序列保守性。这些MYB蛋白在C端均含有一个第6MYB亚家族(Sg6)特有的保守基序(KPRPR[T／S])。对GhPAP1A、GhPAP2A、GhPAP1D和GhPAP2D蛋白与拟南芥次生代谢调控相关的MYB亚家族成员的进化树构建和检测分析,发现陆地棉中这4个PAP1同源蛋白均被分到第6亚组(Sg6),说明这4个同源基因与Sg6亚家族的MYB蛋白基因在进化上是同源的。Sg6亚家族的MYB蛋白参与植物花色素的合成调控,推测GhPAP1A.GhPAP2A.GhPAP1D和GhPAP2D蛋白均属于Sg6亚家族的R2R3-MYB蛋白,具有调控植物花色素合成的功能。2.PAP1同源基因的异位表达为研究克隆的PAP1同源基因的生物学功能,构建了4个棉花PAP1同源基因序列(GhPAP1A-Rs、GhPAP1A-G、GhPAP2A和GhPAP2D)的超量表达载体并通过农杆菌介导法转入烟草中。结果发现,4种PAP1同源基因序列的超量表达均能上调花色素结构基因的表达,进而促进转基因烟草中花色素的合成和积累。以上结果表明来源于亚红株和正常绿株的GhPAP1A基因(GhPAP1A-Rs和GhPAP1A-G),以及GhPAP2A和GhPAP2D基因均能编码有功能的R2R3-MYB蛋白,促进花色素的合成。3.PAPl同源基因的表达分析为进一步探究棉花PAP1同源基因和亚红植株中花色素途径调控的关系,利用定量RT-PCR检测了亚红株棉中GhPAP1A、GhPAP2A、GhPAP1D和GhPAP2D基因的相对表达量。结果显示,在亚红株棉和绿株棉中GhPAP2A、GhPAP1D和GhPAP2D基因的表达水平均较低且无明显差异,但是GhPAP1A基因在亚红株棉中的表达水平有着显著的升高且远远高于在绿株棉中的表达水平。推测GhPAP2A基因可能在亚红株棉的花色素合成中起着关键的调控作用。4.GhPAP1A的启动子研究为研究GhPAP1A基因与亚红株棉中花色素合成的关系,分别在亚红株棉和绿株棉中克隆了GhPAP1A基因ORF上游约2.5kb的启动子序列(pGhPAP1A)。通过核苷酸序列比对发现,在亚红株棉中的pGhPAP1A比在绿株棉中多一段50bp的重复序列。利用亚红株棉×绿株棉的F2群体检测了重复序列与亚红株的连锁关系。GhPAP1A启动子区域的重复序列与亚红株(Rs)基因完全连锁,表明GhPAP1A基因是陆地棉亚红株突变体中花色素合成的关键调控基因。综合上述结果,我们推测GhPAP1A基因是亚红株(尺s)的候选基因,该基因的启动子序列变化导致编码序列高表达,从而促进了棉花的花色素合成和积累。
【作者】赵佳；
【导师】肖月华；
【作者基本信息】西南大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】亚红株棉；花色素；R2R3-MYB蛋白；Rs；

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